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由赭曲霉(Aspergiltus Ochratoxin)和硫色曲霉(A.sulphureus)等產(chǎn)生的赭曲霉毒素(Ochratoxin)有A、B、C、D 四種化合物。其中，赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是重具衛(wèi)生學意義的霉菌代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素A 是一種強致死性化合物，它會導致肝、腎壞死性病變。對雛鴨經(jīng)口測試， LD50 僅為0.5mg/kg體重，其毒性與黃曲霉素相當。在肝癌高發(fā)區(qū)的谷物中可分離出赭曲霉素。赭曲霉素A 的污染范圍較廣，幾乎可污染玉米，小麥等所有的谷物和中藥材。

目前已有糧食和食品中赭曲霉毒素A 的檢驗標準。本文以薏苡仁、淡豆豉和白扁豆為基質(zhì)，發(fā)展赭曲霉毒素A 的前處理和分離檢測方法，以期對同類型的檢測提供參考。

樣品前處理

提取液

甲醇：水 (8:2, v:v)。

PBS 溶液

稱取8 g 氯化鈉、1.2 g 磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀，溶解于990 mL 水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 7，用水稀釋至1 L。

清洗液緩沖

稱取25 g 氯化鈉、5 g 碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL 吐溫-20，用水稀釋至1 L。稱取15 g 中藥樣品加入到50 mL 離心管中，加入30 mL 提取液，加入0.75 g氯化鈉，振搖后渦旋3 min，超聲20 min，中間振搖3 次，11000 r/min 離心15 min后取上清液。取2 mL 上清液, 氮吹除去大部分的甲醇后，用PBS 溶液定容到10mL，過0.22 um 濾膜。取過濾后的提取液5 mL，以1 滴每3 秒流速流過免疫親和柱，然后2~4 mL 空氣排空，10 mL 清洗緩沖液、10 mL 水依次淋洗免疫親和柱，棄去淋洗液，抽干小柱。1.5 mL 甲醇洗脫，40 ℃下氮氣吹干，用流動相定容至1 mL，供檢測。

測試用對照品的配制

使用流動相將10 mg/L 的赭曲霉毒素A 標準溶液依次稀釋成3.13 μg/L、6.25μg/L、12.50 μg/L、25.00 μg/L、50.00 μg/L、100.00 μg/L 和200.00 μg/L 的線性標準溶液。

色譜條件

色譜柱（貨號）:Acclaim C18

 4.6×150 mm,5 μm(貨號：059148)

流動相：乙腈：水：冰醋酸 (48:51:1, v:v:v)

流速：1mL/min

檢測器：熒光，Ex: 333nm；Em: 460nm

柱溫：30℃

進樣量：20μL

儀器：Ultimate 3000

實驗譜圖

1

線性

圖1 線性疊加譜圖（從低到高依次代表濃度為3.13 μg/L、6.25 μg/L、12.50 μg/L、25.00 μg/L、50.00μg/L、100.00 μg/L 和200.00 μg/L 的OTA 標準溶液）

圖2 OTA 標準曲線圖

表1 赭曲霉毒素A 線性曲線

名稱 線性曲線

OTA A = 6166C + 12898，R² = 1.000

2

重復性

圖3 低濃度樣品(3.13 μg/L OTA)重復性

表2 低濃度樣品進樣重復性

名稱 保留時間 RSD% 峰面積 RSD% 樣品濃度（μg/L）

OTA 0.09% 0.67 % 3.13

圖4 高濃度樣品(200 μg/L OTA)重復性

表3 高濃度樣品進樣重復性

名稱 保留時間 RSD% 峰面積 RSD% 樣品濃度（μg/L）

OTA 0.01% 0.11% 200

實驗數(shù)據(jù)

檢出限和定量限

圖5 檢出限 (0.15 μg/L OTA)譜圖與空白疊加譜圖

圖6 定量限 (0.55 μg/L OTA)譜圖與空白疊加譜圖

表4 赭曲霉毒素A 的LOD 和LOQ

名稱 保留時間（min）

LOD(S/N=3)

(μg/L)

LOQ(S/N=10)

(μg/L)

OTA 9.05 0.15 0.55

回收率

圖7 薏苡仁加標回收

1- 薏苡仁樣品加標； 2-赭曲霉毒素A 對照品； 3-薏苡仁樣品

圖8 淡豆豉加標回收

1-淡豆豉樣品加標； 2-赭曲霉毒素A 對照品； 3 淡豆豉樣品

圖9 白扁豆加標回收

1-白扁豆樣品加標； 2-赭曲霉毒素A 對照品； 3-白扁豆樣品

表5 回收率數(shù)據(jù)

名稱 加標量（μg/L） 加標回收率（%）

薏苡米 2.5 99.8

淡豆豉 2.5 100.2

白扁豆 2.5 97.4

結論

本文參考《SNT 1940-2007 進出口食品中赭曲霉毒素A 的測定方法》、《SNT1746-2006 進出口大豆、油菜籽和食用植物油中赭曲霉毒素A 的檢驗方法》和《方法報告-2013-APP-RLC-058-免疫親和液相熒光法測定飼料中的赭曲霉毒素A》發(fā)展赭曲霉毒素A 測定的方法。以赭曲霉毒素A 對照品為樣品，考察了液相方法的檢測限、檢出限和線性范圍。以薏苡仁、白扁豆和淡豆豉為基質(zhì)，考察了前處理方法的凈化能力和基質(zhì)干擾情況。結果表明，該前處理方法回收率高、具有較好的凈化能力，赭曲霉毒素A 出峰位置附近無干擾峰，可用于薏苡仁、白扁豆和淡豆豉赭曲霉毒素A 的檢測。液相方法重復性好、具有較寬的線性范圍、較低的檢測限和檢出限。